揺らぎ・圧力・熱力学

「圧力実験からわかるタンパク質の構造変化」

■背景
温度に比べ、圧力を変化させることができる実験技術の発展が遅れているため、圧力に対する分子や細胞、生物の応答については未解明な部分が多いです。深海の世界は高圧力ですが、深海生物のタンパク質や分子間の相互作用はどのような影響を受けるのでしょうか？圧力実験をすることで何がわかるのでしょうか？その幾つかを紹介します。

■研究概要
数百〜数万気圧の静水圧を用います。水深１０メートルで約１気圧増加しますので、世界で最も深いマリアナ海溝（約-１１，０００ m)などの深海やそれ以上の環境も実験室で作り出せるのです。圧力は、深海生物の研究のみならず、分子の物理平衡、化学平衡を調べる道具（環境因子）としても有用です。例えば、水の相図がありますが、１気圧ではお馴染みの氷Iなどわずかな相の観測しかできませんが、１０００気圧〜１０，０００気圧では、氷II、III、V、VI ...と１０程度の相が存在します。タンパク質でいうと、常温・常圧で最も安定に存在する構造はよく知られていますが、「わずかに存在する構造」はほとんど研究されていません。この「わずかに存在する構造」への転移を、「構造揺らぎ」と言ったりします。熱力学的には、そのような構造は生理条件下でも存在するといえ（化学平衡）、タンパク質の働きや、プリオン病などタンパク質の異常凝集疾患に関わっている可能性が指摘されています^1,2。圧力により物理平衡、化学平衡を変化させることで、「わずかに存在する構造」の濃度を増加させることができます。例えば、圧力を使った核磁気共鳴（NMR)実験によりタンパク質の「わずかに存在する構造」の原子座標決定に成功しました（図１）。

図１　ユビキチンの最安定状態（N1）と準安定状態（N2）の２０構造モデル。N1構造は、野生型ユビキチンについて、１気圧、298 Kにて解明された（PDB:1D3Z)。N2構造は、ユビキチンQ41N変異体について、2500気圧、298 Kにて解明された (PDB:2RU6)。N2構造は、生理条件下では10%程度しか存在しない「わずかに存在する構造」であり、１０マイクロ秒程度の時間スケールでN1とN2の２構造間を行き来しています。N2構造は、C末端領域の配向がN1構造に比べ外側に反っています。変化している領域は標的タンパク質との相互作用部位も含んでおり、機能への影響が予想されます。

■科学的・社会的意義
多くの薬はタンパク質に作用します。標的となるタンパク質のかたちがわかれば、病気につながる分子間相互作用を阻害したりする医薬品の設計ができます。これを構造に基づく医薬品設計（Structure-Based- Drug -Design）といいます。タンパク質の「わずかに存在する構造」にまでこの手法を拡張することにより、より合理的な医薬品開発につながる可能性が有ります。

■参考文献
１）Kitazawa , S. et al. (2014). "Close Identity between Alternatively Folded State N2 of Ubiquitin and the Conformation of the Protein Bound to the Ubiquitin-Activating Enzyme." Biochemistry 53: 447-449.
２）Kuwata et al. (2007). "Hot Spots in Prion Protein for Pathogenic conversion. PNAS USA 104: 11921-11926.

■良く使用する材料・機器
１）核磁気共鳴装置(NMR)　（ブルカー・バイオスピン株式会社）
２）実験試薬　（和光純薬工業株式会社、ナカライテスク株式会社）
３）無細胞系でのタンパク質発現・無細胞くん（大陽日酸株式会社）

H27年度分野別専門委員
立命館大学・薬学部
北原亮　（きたはらりょう）
https://www.ritsumei.ac.jp/pharmacy/kitahara/kitahara_lab.html

「分子の運動や反応を支配する一般法則」

■背景
タンパク質やDNAやRNAといった核酸、糖、脂質二重膜などは生体を構成する代表的な分子ですが、これらのほとんどは非常に複雑な構造を持ち、さらに複数の分子同士がお互いに集まることで非常に巨大な系を作り出します。そしてこれらの分子は私たちの体の中である決まった構造を取るのではなく、常に揺らぎながら存在していることが知られています。その揺らぎのもととなるのが分子の熱運動であり、生物の体の中にある分子は盛んに熱運動を行いながら、様々な化学反応や機能を発揮しています。もしこの熱運動が無いとすれば、生体分子は生きていくために必要な、いかなる反応も行うことができません。従って熱運動とそれがもたらす揺らぎは生物にとって最も基本となるエネルギー源であるといえます。そして熱運動を行う分子は様々な化学反応を行いますが、この時反応は全く無秩序に起こる訳ではありません。「熱力学」という物理法則に従って反応が進んでいきます。そしてその方向性を決めるのがギブスの自由エネルギー（G）と呼ばれる物理量で、全ての化学反応はこのGが低くなる様に、即ち自由エネルギー変化（ΔG）が負になる方向へ進むことが決まっています（図１）。このΔGはさらに生体内では発熱量に相当するエンタルピー（ΔH）変化と系の乱雑さの変化を示すエントロピー変化（ΔS）および温度Tを用いて ΔG = ΔH + TΔSのように表すことができます。ここでΔHやΔSは反応を決める非常に重要な物理量ですが、それぞれ温度や圧力に依存するため、それらを変えると反応の方向性や効率が変化します。この温度や圧力の依存性は分子の構造や反応過程の機構を反映しているため、それらを変えた実験を行うことで生体分子の構造や揺らぎについてより詳細な知見を得ることができます。また化学反応は必ずΔGが負になる方向へと進行しますが、この時多くの反応では不安定な活性中間体を経る必要があります。この活性中間体の反応物に対するギブス自由エネルギーの差は活性化エネルギー（ΔG‡）と呼ばれ、D‡が大きいほど反応速度が高く、短い反応時間で反応が進行するのに対し、逆にΔG‡が小さいとより長い時間を反応に要することになります。そして生体分子はこのΔG‡を調節することでより生存に適した速度で化学反応を進めていると考えられています。

図１　化学反応の方向姓はギブスの自由エネルギー（G）によって決まり、よりGが小さくなる方向へと進行する。またその反応速度は活性化自由エネルギー（ΔG‡）によって決まり、ΔG‡が小さいほど反応がより速く進行する。

図２　過渡回折格子（TG）法によって明らかになった、SrSRIの各光反応中間体のエンタルピーダイアグラム。タンパク質に塩化物イオンが結合すると、各中間体のエンタルピーが大きく上昇する。

■研究概要
これまでGやH、Sといった熱力学量は、温度や圧力を変えた時に、平衡状態にある分子の割合がどう変化するのかを調べることで、平衡下にあるそれぞれの化学種の相対的な値を求めることで研究が行われてきました。しかし生体反応の多くは平衡反応だけではなく、一方向だけに反応が進行する逐次反応であり、一般にその途中には多くの反応中間体が現れますが、それらの反応中間体について上記のような熱力学量を決めるのは困難でした。しかし私たちは最近パルスレーザーを使った過渡回折格子法（TG法）と呼ばれる分光法で中間体のエンタルピーを決定することに成功しました。TG法ではごく短い時間（ナノ秒（十億分の一秒）程度）だけ試料に光を照射して、その中に含まれる分子を一度に光反応させ、その後に起こる反応過程に沿って生じる屈折率変化を測定できる手法です。この時光を吸収した分子が中間体へと変化していくと徐々にエネルギーが熱として放出されていきますが、熱が放出されると試料の屈折率が変化するため、それを正確に測定することで様々な中間体の持つエンタルピーを決定することができます。
私たちはこのTG法を使ってSalinibacter ruberという細菌が持つ光受容タンパク質である、センサリーロドプシンＩ（SrSRI）の光反応過程を調べました。その結果図２に示すようにSrSRIの光反応の経路上に存在する大部分の中間体について、その始状態からの相対エントロピー（ΔH）を決めることに成功しました。さらにSrSRIは塩化物イオンを結合する事が知られていますが、全ての中間体においてこのΔHが塩化物イオンの結合と共に上昇することが明らかとなりました。このことは塩化物イオンが結合する事でタンパク質の反応速度や構造に違いが生じ、それが機能と深く結びついていることを示唆しています。このような結果はレーザー分光と熱力学研究を組み合わせることで、初めて可能になったものであり、現在より詳細な知見を得るために、さらに詳細な研究を行っています。

■科学的・社会的意義
生体反応は生き物が生きていくために必要なものの中で、最も基本的な過程です。その原理を熱力学で明らかにすることは生化学的な知見を増やすだけでなく、様々な反応を自由に制御するという目標にもつながるものであり、将来的には製薬や医療といった応用的な分野へも貢献が期待されます。

■参考文献
１）Inoue, K., et al. (2011). "Spectrally Silent Intermediates during the Photochemical Reactions of Salinibacter Sensory Rhodopsin I." J. Phys. Chem. B 112(8): 2542-2547.

■良く使用する材料・機器
１） Nd3+:YAGレーザー（INDY 40）（Spectra Physics）
２）デジタルホスファオシロスコープ（テクトロニクス）
３）実験試薬　（和光純薬株式会社）

H24年度分野別専門委員
名古屋工業大学・大学院工学研究科・未来材料創成工学専攻
井上圭一　（いのうえけいいち）
http://www.ach.nitech.ac.jp/~physchem/kandori/index_j.html